正常与退变髓核细胞形态学及Ⅱ型胶原蛋白的定量分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎间盘退变导致椎间隙狭窄的主要变化是髓核细胞表达软骨特异性基因产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的减少。
目的：对成人的正常与退变椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色及番红O染色进行定量观察比较。
方法：取成人脊柱侧弯患者与椎间盘突出症患者自愿者术中取出的废弃髓核组织各3例，经培养后每个患者各测量26个细胞，正常组和退变组分别测量78个细胞。对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色并行灰度及测定细胞内Ⅱ型胶原蛋白行免疫荧光染色定量测定。
结果与结论：免疫荧光染色显示：退变椎间盘髓核细胞仅轻度染色，染色模糊，其呈类圆形，纺锤形，梭形及不规则形，其内仅有极少量荧光颗粒；Ⅱ型胶原表达较正常髓核细胞降低显著(P < 0.05)。番红O染色显示：退变的髓核细胞肿胀，细胞核肿胀染色略淡，细胞突起延长，胞浆染色不匀伴有空泡，部分细胞崩解，细胞分布零散，混乱，可见成片坏死区。与正常髓核细胞图像灰度值相比差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明退变的椎间盘髓核细胞减少、部分凋亡，其细胞内Ⅱ型胶原蛋白含量较正常髓核细胞显著减少。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 椎间盘, 髓核细胞, Ⅱ型胶原, 番红O染色

Abstract:

BACKGROUND: The narrowing of intervertebral space induced by the intervertebral disc degeneration is mainly characterized by the expression of proteoglycan in nucleus pulposus cells and the reduction of collagen type II.
OBJECTIVE: To quantitatively observe collagen type II protein in adult normal and degenerative intervertebral disc nucleus pulposus cells by immunofluorescence staining and safranin O staining.
METHODS: The nucleus pulposus specimens were collected from adult scoliosis patients and patients with intervertebral disc protrusion, who were all volunteers. After culture, 26 cells in each patient were measured. There were 78 cells in both normal group and degeneration group. The normal and degenerative intervertebral disc nucleus pulposus cells were subjected to safranin “O” staining, and gray values were determined; intracellular collagen type II was detected by immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescence staining revealed that, degenerative intervertebral disc nucleus pulposus cells were only mildly stained, with the fuzzy staining, the shape was round, spindle, fusiform and irregular. There were a very small amount of fluorescent particles within cells. The expression of collagen type II was decreased significantly compared with normal cells (P < 0.05). Safranin O staining showed that, degenerative nucleus pulposus cells began to swell, the nuclei swelled and were stained slightly, cell processes were prolonged, cytoplasmic dyeing was uneven accompanying with vacuole, cell disruption, scattered and chaotic distribution were visible, patches of necrosis were observed. The image gray value showed no significant difference compared with normal nucleus pulposus cells (P > 0.05). The degenerative intervertebral disc nucleus pulposus cells have a small quantity and partially become apoptotic, the content of collegen type II protein is decreased significantly compared with normal nucleus pulposus cells.

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Key words: intervertebral disc, intervertebral disc degeneration, collagen type II

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

2.1 人椎间盘正常髓核细胞和退变髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色结果 正常髓核细胞染成深浅不一的绿荧光，细胞形态清晰可见，为短梭形及多角形，细胞核绿色荧光颗粒含量高染色深，胞浆内绿色荧光颗粒少染色浅(图1A)。退变髓核细胞则染色较均匀模糊，形态尚清呈类圆形，纺锤形及不规则形，胞核胞浆分界不明显，细胞内荧光颗粒含量少，有部分细胞破裂，胞浆外溢(图1B)。

2.2 人椎间盘正常髓核细胞和退变髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白吸光度值 显微图像处理软件(Image Pro 5.1，Olympus公司)图像分析显示：吸光度平均值，累积吸光度值(IA)及测量面积(Area)，吸光度平均值=累积吸光度值/测量面积。正常和退变髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白吸光度平均值采用独立样本t 检验。正常组Ⅱ型胶原蛋白显著高于退变组(109.78±10.80，40.78±3.94，P < 0.05，n=78，图2A)。

2.3 正常髓核细胞和退变髓核细胞番红O染色结果 正常椎间盘的髓核细胞以梭形、多角形多见，细胞核染色深，以核仁为着，胞浆染色略淡为均匀粉红，可见细胞突起短而粗，细胞排列紧密规则，呈漩涡状或火焰状(图1C，E)。退变的髓核细胞肿胀，呈纺锤形及不规则形，细胞核肿胀染色略淡，细胞的突起延长，胞浆染色不匀伴有空泡，部分细胞崩解，细胞分布零散，混乱，可见成片坏死区(图1D，F)。

2.4 正常髓核细胞和退变髓核细胞番红O染色灰度值比较 显微图像处理软件进行灰度值比较：正常和退变组髓核细胞的番红染色吸光度平均值比较差异无显著性意义(16.18±1.65，16.99±1.17，P > 0.05，n=78，图2B)。

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引言

椎间盘是一个用于连接相邻两个椎体独特复杂的纤维性结构，不仅可以保持脊柱的高度，而且是脊柱的负重、运动及吸收震荡的重要结构，同时它也维持脊柱的生理曲度和正常姿势。
椎间盘是由软骨终板、纤维环和髓核3部分组成。它们有着各自的生理功能：髓核在椎间盘的中央偏后位置，占据了椎间盘50%-60%的横断面积，主要由蛋白多糖、水和Ⅱ型胶原构成，由于具有吸水特性的蛋白多糖紧密附着在Ⅱ型胶原上，使其有良好的弹性和膨胀性，可以吸收震荡缓冲外力；纤维环由紧密环绕髓核外层的胶原纤维构成，其胶原纤维含量明显高于髓核，使其具有很好的张力强度，更好的吸收震荡保持脊柱运动的稳定；软骨终板则是透明软骨，也具有吸收震荡作用，保持脊柱的弹性，同时也是椎间盘内物质代谢交换的通道。这些成分合理的组织在一起维持椎间盘的正常生理功能。
正常情况下，椎间盘细胞外基质不断的进行自我更新，维持良好的自我平衡状态。除了分泌细胞外基质，髓核细胞还分泌大量的蛋白水解酶，如基质金属蛋白、整合素、糖胺多糖水解酶、胶原酶等，降解细胞外基质。细胞外基质降低，导致交联状排列的胶原纤维增多、椎间盘硬化。另一方面，分解代谢加快，导致蛋白多糖含量降低。椎间盘细胞外基质代谢平衡破坏的因素很多，包括代谢环境的改变，基因表达倾向性改变，生物力学改变等。炎症递质，如白细胞介素1，6，一氧化氮，前列腺素E2，肿瘤坏死因数a等均有上调分解代谢通路、加速椎间盘退变的作用^[1] 。
随着年龄的增大，椎体软骨终板渗透性降低，营养物质不能有效的供给，椎间盘的代谢受到破坏。吸烟等因素可以加速软骨终板微孔的改变，加速椎间盘的退变。椎间盘代谢的改变，可导致髓核细胞的死亡或活性降低，从而降低了细胞外蛋白多糖的含量。同时，髓核细胞表型特征从类软骨细胞分化为成纤维样细胞，Ⅰ型胶原取代Ⅱ型胶原。生物力学的改变也影响着椎间盘生物学行为的改变，细胞外的结构蛋白和细胞膜为了适应应力，必须改变形状，这有可能促发基因表达的改变和蛋白质的合成。所以脊柱不稳或畸形的患者较正常人易发生椎间盘退变^[1] 。
分解代谢的加速、蛋白多糖浓度的降低、Ⅰ型胶原取代Ⅱ型胶原等因素，导致椎间盘髓核水分减少，静水压降低，椎间盘开始塌陷，纤维环和周围韧带撕裂。椎间盘微小的不稳定继续发展加上不正常的生物力学行为加速了椎间盘的退变。这一级联反应最终将导致脊柱不稳、炎症改变、椎间盘突出。引起腰背疼痛、神经根病变、肌肉劳损等疾病^[1] 。
虽然1980年前美国医生Mixter和Barr的《累及椎管的椎间盘破裂》的论文阐明腰椎间盘突出症的实质，但目前仍没有真正能够根治本病的治疗方法，这主要是因为本病的确切病因机制仍不很清楚，因此许多国内外研究者从细胞水平对其病因、危险因素等方面研究观察^[1-11] 。他们利用多种染色技术对不同的生物种类椎间盘髓核细胞生物形态和Ⅱ型胶原的观察，但并没有利用计算机软件技术对人正常和退变的髓核细胞进行定量测量比较分析。
本实验采用的番红O是一种能结合多阴离子的阳离子碱性染料^[12] ，也就是说一个染料分子与6-硫酸软骨素或者硫酸角质素的一个负电荷集团相结合，并且不与胶原结合^[13] ，髓核细胞中的蛋白聚糖主要包括包括硫酸软骨素或者硫酸角质素，硫酸软骨素按取代基的部位分为6-硫酸软骨素和4-硫酸软骨素。番红O染色可间接反映硫酸软骨素或者硫酸角质素的含量和分布，并可行化学定量测定。
免疫荧光细胞化学是依据抗原抗体反应的原理，将标记有已知的抗原或抗体上荧光素的荧光标记物作为分子探针检查分布在细胞或组织内的相应抗原(或抗体)，所形成的抗原抗体复合物含有荧光素，这样利用荧光显微镜观察该标本，荧光素因受到激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，由此可以看见荧光所在的细胞或组织，从而可以对抗原或抗体定性、定位，并利用定量技术测定含量。
利用荧光抗体示踪或者检查相应抗原的方法称作荧光抗体法；利用已知荧光抗原标记物示踪或者检查相应抗体的方法称作荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用，故本实验选用Ⅱ型胶原抗体。荧光免疫显微技术用有抗原抗体反应的高度特异性，并能在荧光显微镜下清晰地显现其形态，有很强的直观性，而且无论是新鲜或陈旧标本，只要处理得当，都不会影响其结果判定。
本实验通过对脊柱侧弯矫形手术的患者与腰椎间盘突出症手术的患者所取出的废弃髓核组织分离的髓核细胞进行细胞形态学和Ⅱ型胶原定量比较，以期从细胞生物学的角度发现椎间盘退变细胞骨架的变化，为髓核组织工程学在椎间盘退行性疾病中的应用提供相应的思路和理论依据，并为椎间盘突出症的治疗中寻找如何修复损伤的椎间盘、怎样延缓和逆转椎间盘退变的潜在方法提供相关的实验依据^[14-15] 。

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材料方法

设计：分组对比观察。

时间及地点：实验于2013年7月在山西医科大学附属太原市中心医院骨科完成。

材料：髓核细胞取自脊柱侧弯13-16岁的女孩与椎间盘突出症50-60周岁自愿患者各3例，术中取出的废弃髓核组织(伦理委员会审核同意)。

方法：

人髓核细胞的制备：于无菌条件下将3例术中取出的废弃髓核组织半小时内带到验室，在无菌超净工作台上，采用D-Hanks 液反复冲洗3次彻底除去血污、纤维环及软骨终板，再用10 mL PBS清洗3次，无菌眼科剪把髓核组织剪成碎块约1 mm×1 mm×1 mm，滴入2.5 g/L胰蛋白酶2 mL浸润瓶底，37 ℃、体积分数5%CO₂恒温箱放置20 min，摇动5 min/次，1 000 r/min离心3次5 min/次，每次弃上清液，用Ⅱ型胶原酶在37 ℃下消化2-4 h，120目尼龙网筛进行过滤，使用PBS液悬浮细胞，离心5 min以800-1 000 r/min的速度，弃去上清液，于含体积分数20%小牛血清的DMEM/F12培养基上培养髓核细胞，并置于恒湿37 ℃恒湿的CO₂孵箱内，每2 d换液1次进行原代培养。

人髓核细胞内Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色：培养了7-15 d的髓核原代细胞用10 mL PBS轻轻清洗3次， 5 min/次，于恒湿37 ℃恒湿的CO₂孵箱内中40 g/L多聚甲醛固定30 min；室温下0.1% Triton X-100的PBS处理 5 min。下面步骤在避光条件下操作：室温下湿盒中加入Ⅱ型胶原一抗培养2 h，5 mL PBS液清洗3次，5 min/次，湿盒中加入FITC标记的二抗于室温孵育1 h；5 mL PBS清洗3次，5 min/次，每例患者椎间盘髓核细胞随机选取13份样本进行水封片，共78个水封片，倒置荧光显微镜观察。

人髓核细胞番红O染色：同样培养7-15 d的髓核细胞78份，于恒湿37 ℃恒湿的CO₂孵箱内中40 g/L多聚甲醛中固定，15%乙二胺四乙酸二钠(pH 7.15)溶液浸泡，连续脱钙12 d(2 d/次换液)，浸蜡包埋4.0-5.0 µm连续切片。切片进行常规脱蜡至水，生理盐水冲洗，用0.5%番红O染液滴染1 min，镜下体积分数95%乙醇分化30 s，风干后透明用二甲苯，封固使用中性树胶。

主要观察指标： ①成人正常髓核细胞与退变髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色及吸光度平均值比较。②正常髓核细胞与退变髓核细胞番红O染色及灰度值的比较。

统计学分析：使用显微图像处理软件(Image Pro 5.1，司)对免疫荧光染色图像进行吸光度平均值测量及Olympus公对番红O染色进行灰度值测量，并分别对两样本间比较采用t 检验，以x(_)±s表示实验数据，数据处理和统计学分析使用SPSS 19.0统计学软件，认为P < 0.05差异有显著性意义。图表采用OriginPro7.5制作。

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讨论

椎间盘膜为椎间盘的原始结构，后期形成脊柱的前纵韧带、外纵韧带和后纵韧带，其延伸部分将椎间盘的原基分为两半。作为间质区的实性条索脊索，在受到持续压力作用下被压到生骨节致密区间的生骨节间隙。脊索细胞则不断地移行到椎间盘组织内，并发生粘液变和增生，最后形成髓核，其生长速度较纤维环快。早期椎间盘的营养由深入其中的血管供给，出生不久后血管逐渐变少、变细，成年后大部分血管基本消失。这些血管穿入软骨终板所留下的裂隙被瘢痕组织修复，最终由于髓核的不断胀大成为抵抗力减低区域，甚至有的髓核有该处脱垂从而形成Schmorl结节。髓核并没有血管直接供应。
成人椎体松质骨通过软骨终板弥散、渗透对椎间盘进行仅有的营养供给^[16] ，其髓核组织随着年龄的增长逐渐被纤维组织代替，失去胶冻状性质。脊柱退变始于椎间盘，30岁后发生退变椎间盘生物力学发生改变加之外力的作用使退变进一步加剧，其纤维环撕裂使髓核含水量减少，引起椎间盘膨出或突出，从而导致椎间隙狭窄出现一系列临床症状。
早期的椎间盘退变的治疗方式为非手术的保守治疗，如物理治疗、口服非类固醇抗炎药物、防止骨质疏松治疗等^[17-19] 。而对与保守治疗无效的患者，根据病情给予手术摘除病变的椎间盘、相应椎体间融合，疗效满意，但后期由于加速了邻近节段椎间盘的退变又出现临床症状。当然也有人工椎间盘置换、髓核置换等可以维持椎体间的运动的非融合手术方式，但其需要术者有高超的手术技巧，并需要高昂的手术费用，而且并不能完全取代人类正常椎间盘所具有的生理生化性质、生物力学稳定性等^[20-22] 。并且正常椎间盘细胞营养及代谢由髓核细胞维持动态平衡。所以由上述椎间盘的发育、营养供给及髓核细胞的功能，可见髓核细胞维持正常椎间盘的生理功能具有重要作用。其实椎间盘主要的变化是髓核细胞表达的软骨特异性基因产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的减少[^23-24] 。
实验由正常和退变髓核细胞的番红O染色和倒置相差显微镜对照发现：退变髓核细胞数量减少，稀疏，排列紊乱，细胞形态不规则，伴有部分细胞坏死，甚至出现坏死片。这可能与细胞退变后其的支架结构减少有关^[25] 。
国外学者的染料实验证明：番红O染色强度曲线与邻近软骨的固定电荷密度曲线呈现线性相关(r =0.900-0.995)；并且染色的分布在切片上始终保持一致。这样番红O染色就可间接的反映硫酸软骨素或硫酸角质素含量及分布，而髓核细胞中的蛋白聚糖正是主要包括硫酸软骨素或硫酸角质素。
本实验通过正常和退变髓核细胞番红染色对照发现：退变髓核细胞培养中细胞稀疏，排列紊乱，有部分细胞坏死，可见细胞数量减少。细胞数量减少的原因可能与细胞的衰老、死亡及细胞的凋亡有关^[26] 。正常髓核细胞形态为多角形，退变髓核细胞多为纺锤形、梭形、类圆形和不规则形。
Moon等^[27]报道单层培养的髓核细胞的呈多角形，类成纤维细胞则呈梭形和纺锤形，故考虑退变髓核中髓核细胞向类成纤维细胞转化，番红染色及倒置相差显微镜中出现的退变髓核细胞突起及胞浆染色不均匀，形态变小，部分细胞呈现类圆形和不规则形，组织结构分解，完整性消失，组织中出现坏死片，考虑可能与细胞退变后细胞的支架结构减少有关^[28-31] 。这一结果对组织工程椎间盘制备中种子细胞的选取具有一定的参考价值。
有研究认为，髓核细胞的活性、新陈代谢与细胞的密度、葡萄糖的浓度、氧浓度以及pH值有关。Roberts等^[32]研究认为，在退变的椎间盘中软骨终板钙化，由血管弥散入椎间盘细胞内营养物质微乎其微，而乳酸等代谢产物不又能及时排除，堆积在椎间盘内无法排出，导致椎间盘内 pH值降低，髓核细胞凋亡。
椎间盘细胞的代谢需要消耗的大量氧气，而产生二氧化碳则很少，这样在低氧环境下，髓核细胞易失活，基质合成将减少^[33] 。通过计算机图像分析番红染色其基质灰度值变化与正常髓核比较差异并无统计学意义，考虑髓核细胞体内处在高压力的无氧环境，在体外培养的髓核细胞处则在有氧无压力的适宜生长环境。这样说明在体外单层培养的原代退变髓核细胞内的糖胺多糖的合成合成良好、分布均匀，其存活良好。
Ⅱ型胶原因富含有羟赖氨酸残基，糖化作用大，并具有高羟化性能，含水量大，所以更适于吸收传递压应力。正是这些作用，与作为脊柱中央“轴承”的髓核具有吸收传递椎体压力的生理功能相一致^[34-36] 。而椎间盘退变后蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、水分含量减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原增多，逐渐纤维样变化，失去黏弹特性，这种变化与退变程度正相关^[37] 。
实验番红O染色观察到退变髓核细胞多为纺锤形、梭形、类圆形和不规则形，向类成纤维细胞转化。利用软件image-pro Plus 5.1对免疫荧光染色的Ⅱ型胶原进行定量分析，吸光度平均值反应则Ⅱ型胶原在单位面积细胞上的含量。其结果也证实了正常髓核细胞的Ⅱ型胶原含量显著高于退变髓核细胞，它们的比较差异有统计学意义。同时也可以看到细胞形态发生改变，细胞染色则呈云雾状，这也证实髓核细胞合成Ⅱ型胶原能力显著降低，伴随细胞衰老，物质的合成与代谢出现失衡，从而细胞发生溶解、凋亡。
实验利用染色技术同计算机软件相结合对细胞形态及Ⅱ型胶原蛋白的定量的分析比较，证实了在退变的椎间盘中髓核细胞减少、凋亡，髓核细胞内的Ⅱ型胶原蛋白含量明显减少^[38-47] 。这样髓核的弹性和膨胀性下降，吸收震荡的能力减弱，导致椎间盘、椎间小关节、椎体及周围结缔组织的一系列退行性改变。因此，怎样延缓细胞衰老、凋亡，增加细胞外基质分泌，促使细胞永生，怎样构建组织工程椎间盘，是今后亟需解决的问题。希望随着研究的深入，椎间盘退变性疾病治疗观念和模式将发生根本的改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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